脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

1、細(xì)胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、轉(zhuǎn)染前換上沒有抗sheng素的DMEM 胎清(10%)。

3、將質(zhì)粒DNA (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中 DMEM至50u1。

4、脂質(zhì)體5ul補(bǔ)培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:2或1.5:2.5)。

5、將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含質(zhì)粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。

6、吸取混合物均勻加入每一個(gè)孔中。

7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基DMEM6ml 胎清600u1 三抗300u1。

8、培養(yǎng)24小時(shí)。

大鼠gu髓間充質(zhì)gan細(xì)胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞。

(4 )緩慢將細(xì)胞懸液加入預(yù)先裝有5mL淋巴細(xì)胞分離液的15mL離心管內(nèi)，保持細(xì)胞懸液在淋巴細(xì)胞分離液上層，注意不要攪動(dòng)液面,保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質(zhì)細(xì)胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

( 7 ) 24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液(看細(xì)胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，-般10d細(xì)胞生長融合。

(8 )經(jīng)0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

平板克l隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟::

1、取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養(yǎng)液中備用。

2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200 個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37團(tuán)5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的數(shù)。后計(jì)算形成率。細(xì)胞生物學(xué)服務(wù)南京英瀚斯生物科技公司自建有標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)房，配備有生物安全柜、超凈工作臺(tái)、細(xì)胞三氣培養(yǎng)箱、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、體視鏡、、流式細(xì)胞儀等設(shè)備。形成率= (數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) x100%平板形成試驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。平板形成試驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞- -定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。