RNA提取

1.棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次1-2。

2.棄去PBS，用1000u1槍吸干凈殘余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管標(biāo)號與每孔相對應(yīng)備用。

5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的 EP管中國。

6.往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s， 冰上靜置12min[問l。

7. 所有樣品4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 15min.

8. 再次標(biāo)記一批同樣編號EP管。

9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號的EP管中，再加入400ul異充

分混勻。4C冰箱35min。

10. 4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 10min.

11.棄去.上清液，加1m175%乙醇，輕搖7]。

12. 4C離心，10600轉(zhuǎn)/分鐘，時間: 5min.

13. 棄上清液濾紙吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測濃度。

組織RNA提取

1、剪米粒大小組織塊放入EP管中標(biāo)號。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜。

4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。

  全轉(zhuǎn)錄組測序    

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mRNA和各種noncoding RNA。我們知道生物體本身的轉(zhuǎn)錄過程是一個動態(tài)變化且十分復(fù)雜的分子作用網(wǎng)絡(luò)，如果只是對某個單一RNA分子的研究，有時并不能準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)分子作用機(jī)制。12000r/min于4C離心5min,小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10~15min。而競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)理論闡述了一種全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能夠通過miRNA應(yīng)答元件（microRNA Respe Element, MRE）競爭性地結(jié)合相同的miRNA來調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平。舉個例子：miRNA會導(dǎo)致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncRNA競爭性結(jié)合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實現(xiàn)。

      ceRNA是目前轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的熱點內(nèi)容之一，通過全轉(zhuǎn)錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述ceRNA的分子作用機(jī)制。目前對全轉(zhuǎn)錄組簡便的方法就是構(gòu)建2個測序文庫分別進(jìn)行測序。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究內(nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、ceRNA網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。去除rRNA的鏈特異性文庫，含有的RNA信息含量十分豐富，通過測序和生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA的鑒定及注釋信息。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點。不過該文庫構(gòu)建時會進(jìn)行片段化選擇從而濾掉了small RNA的信息，所以需要另外再構(gòu)建一個small RNA文庫，進(jìn)行測序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鑒定及注釋信息。全轉(zhuǎn)錄組測序方案路線圖如下所示：

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定服務(wù)

蛋白質(zhì)（protein）是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物和生命活動的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、新陳代謝、抵御外來物質(zhì)入l侵及控制遺傳信息等方面都起著重要的作用。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是氨基酸序列，通過鑒定氨基酸序列來匹配它的蛋白質(zhì)，這是定性研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)之一。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。

質(zhì)譜一般由離子源、質(zhì)量分析器（Mass analyzer）和離子檢測器（Detector）三部分組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)等，質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的途徑?，F(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)基本研究手段是：以生物質(zhì)譜技術(shù)為核心，對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模、高通量分離、鑒定和分析。二、大腸菌群檢驗方法:由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞。

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本原理是用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成肽段混合物，經(jīng)MAILDI或ESI等軟電離手段將其離子化，然后通過質(zhì)量分析器將具有特定質(zhì)核比的肽段離子分離開來。通過實際譜圖和理論上蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶消化后產(chǎn)生的一級質(zhì)譜峰圖和二級質(zhì)譜峰圖進(jìn)行的比對，進(jìn)行蛋白鑒定。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚bing烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。