微生物計(jì)數(shù)

3.濾膜法

濾膜法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過(guò)膜過(guò)濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上(或一定面積上)的細(xì)菌數(shù)。

此法也可以通過(guò)培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來(lái)推算樣品中的菌數(shù)。例如測(cè)定飲用水中大腸gan菌的數(shù)目:將已知體積的水過(guò)濾后，將濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上大腸gan菌的菌落呈現(xiàn)黑色，可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計(jì)算出水樣中大腸gan菌的數(shù)目。金黃色葡萄qiu菌(Staphylococcusaureus)是人類(lèi)的一種重要病原菌，隸屬于葡萄qiu菌屬(Staphylococcus)，有"嗜肉菌"的別稱(chēng)，是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重gan染。

此法也是統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。

4.比濁法

原理是在一定范圍內(nèi)，菌是懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可借助與分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。

5.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

在課本生物選修1生物技術(shù)實(shí)踐P22中“除了上述活菌計(jì)數(shù)法外，顯微鏡直接計(jì)數(shù)也是測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法?！边@里說(shuō)的顯微鏡直接計(jì)數(shù)，我認(rèn)為應(yīng)該是在稀釋涂布的基礎(chǔ)上不培養(yǎng)成菌落而通過(guò)染色的方法在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況?！称肺⑸镯?xiàng)目背景——食源病原微生物引起的食源性疾病是食品安全的核心問(wèn)題。

另外，微生物計(jì)數(shù)法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法可以用來(lái)統(tǒng)計(jì)微生物的數(shù)目。

微生物限度檢查

微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。

   當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

   微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

   如供試品有抗jun活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。

   供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

4.供試品中微生物的回收

    微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法或MPN法。

   （1）平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

   傾注法 取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗jun活性的去除或滅活” 制備的供試液1ml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過(guò)45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

   涂布法 取15～20ml溫度不超過(guò)45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱(chēng)為混和培養(yǎng)物(mixedculture)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋” 和“抗jun活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)；采用MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。就是說(shuō)這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長(zhǎng)良好。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

   方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

   供試品檢查

   檢驗(yàn)量

   檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或c㎡）。

   一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)zui小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。

   除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100c㎡；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上zui小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。

   供試品的檢查

   按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。

   胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。

   陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)査。