選擇素elisa試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理

選擇素elisa試劑盒是一類異親型結(jié)合、Ca2 依賴的細(xì)胞粘著分子，能與特異糖基識(shí)別并結(jié)合。主要參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識(shí)別與粘著。

實(shí)驗(yàn)原理：

將目標(biāo)包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入品或標(biāo)本，其中的目標(biāo)連接于固相載體上的結(jié)合，然后加入微生物化的目標(biāo)，將未結(jié)合的生物素洗凈后，加入HRP標(biāo)記和親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)呈正相關(guān)。用酶1標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。

精密度：精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV表示。CV（%）=SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次選擇素elisa試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，每份樣本連續(xù)測(cè)定20次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本定量測(cè)定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定8次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差： CV<10% Inter-批間差： CV<13%

經(jīng)測(cè)定，試劑盒在X期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性率小于5%。為減小外部因素對(duì)試劑盒前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可人為誤差。

選擇素elisa試劑盒識(shí)別的配體都是一些寡糖基團(tuán)，迄今為止發(fā)現(xiàn)的配體都是一些具有唾液酸化路易斯寡糖(s-Le，siaglyl-Lewis)或類似結(jié)構(gòu)的分子。一種寡糖基團(tuán)可以存在多種糖蛋白和糖脂分子上，并分布于多種細(xì)胞表面，因此選擇素分子配體在體內(nèi)分布較為廣泛。

隨著基因組測(cè)序、分子生物學(xué)檢測(cè)手段的快速發(fā)展，PCR和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，正在越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。然而，PCR作為一種高靈敏度的檢測(cè)手段，PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也容易被各種無(wú)關(guān)的外源性DNA或RNA所干擾。

PCR實(shí)驗(yàn)室中，很容易發(fā)生DNA的交叉污染，污染通常來(lái)自于離心管、移液器和其他試驗(yàn)設(shè)備產(chǎn)生的DNA氣溶膠，或DNA溶液污染桌面，或吸樣槍不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)。據(jù)估算，一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000個(gè)DNA拷貝。 因此，為保證PCR試驗(yàn)的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，避免交叉污染，應(yīng)定期對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室做DNA污染情況的監(jiān)測(cè)。

RNA病毒檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 凍干粉為逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶的預(yù)混液，將RNA逆轉(zhuǎn)錄與qPCR擴(kuò)增兩個(gè)過(guò)程合并，一步完成，減少移液次數(shù)、避免交叉污染、操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間。

2. Taq酶具有70°C熱啟動(dòng)功能，顯著提高試劑盒的特異性和敏感度。

3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，性能穩(wěn)定。

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總RNA的抽提方法:

目前常用的方法是用異硫qing酸胍苯1酚抽提法。

提取步驟:

先用液氮研磨材料，勻漿，加入Trizol試劑，進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分。然后加入氯1仿抽提，離心，分離水相和有機(jī)相，收集含有RNA的水相，通過(guò)異丙1醇沉淀，獲得比較純的總RNA,用于下一步mRNA的純化。也可將含有RNA樣品的細(xì)胞破碎液通過(guò)硅膠膜純化柱純化。

RNA濃度和純度判斷:

OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為50 ug/mL;

OD260/0D280值在1.8~ 2.0之間，表示純度較好;

0D260/OD280值低于1.8，樣品有蛋白質(zhì)或酚污染;

0D260/0D280值大于2.0，提取的RNA可能有降解;

電泳后如果rRNA大小完整，而且28S rRNA和18SrRNA亮度接近2:1、mRNA分布均勻，則認(rèn)為RNA。