自噬流檢測

自噬是調(diào)節(jié)真核細鵬生長、和能量代謝的重要生物學(xué)機制。細胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點。由于自噬流是一個曲多個步驟組成的動態(tài)過程。ES細胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態(tài)及其多向分化潛能的生物學(xué)特性,使其廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域,它的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點。因此往需要精細的突驗才能準確判斷自啦流狀態(tài)。

血管生成技術(shù)

一、服務(wù)介紹

zhong瘤血管生成是一個極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞移行、內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。由于zhong瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進入血流并在遠隔部位形成轉(zhuǎn)移。細胞沉淀用15mlMEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細血管性血管的生長。無論原發(fā)性zhong瘤還是繼發(fā)性zhong瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活l細胞計數(shù)，用含20%胎牛血l清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1x106細胞/L。這是由于zhongt瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數(shù)細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

Q:中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？

A:基于多年的實驗研究，用于細胞培養(yǎng)的胎牛以及其它中可能會存在以下種類的沉淀物：

（1）纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達到 1-2mm，可以用肉眼觀察到。因為都是在低溫下進行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當(dāng)經(jīng)過的過濾分裝后，就會在瓶中凝結(jié)出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。共培養(yǎng)-定時間后進行破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一步采用RT-PCR對破骨細胞標志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶。

（2）磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會使出現(xiàn)渾濁，并且在 37℃ 培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點， 這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認為是微生物污染。

（3）膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。他們也是中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。