PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可合成tRNA基因?！钡捎诋敃r基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上分子克1隆技術的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴增基因的途徑，所以Khorana的設想被人們遺忘了。

1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈式反應”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標記法看到了10個循環(huán)后的49 bp長度的第yi個PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請了PCR的專1利，

1987年7月28日批準（專1利號4,683,202 ），Mullis是第yi個發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學術論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法。

PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2 離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

原位PCR( in situ PCR)技術

原位PCR綜合了PCR和原位雜交( Insitu hybridization, ISH)的優(yōu)點是一種在組織切片或細胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進行擴增.再用特異性的探針原位雜交檢測。原位PCR標本一般需先經(jīng)化學固定,以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜有一定的通透性,PCR擴增所需的各種成分可進入細胞內(nèi)或核內(nèi)。在原位對特定的DNA或RNA進行擴增。擴增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過細胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應用ISH將其檢出,同時還可對目的DNA序列的組織細胞進行形態(tài)學分析。