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生豬屠宰場熒光定量PCR服務介紹「多圖」

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發(fā)布時間:2021-07-07 04:57  






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熒光定量PCR技術產(chǎn)生并成熟于上世紀90年代,由于該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,能夠對PCR反應的全過程進行實時監(jiān)控,并且自動化程度高,所以該技術從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時間,在科研及檢驗領域獲得了廣泛的應用,成為分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。在real-timeQ-PCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關的熒光信號,隨著反應時間的進行,監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監(jiān)控PCR反應的進程,并通過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。系統(tǒng)組成:定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

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進行熒光定量PCR體系的配制時i好在冰上進行,操作環(huán)境不用非得在超凈臺中進行,環(huán)境安靜整潔都可以。因為每一個梯度要做三個重復,因此先在1ml的無菌離心管中配制好后再分裝入96孔板中。研究表明熱工過程可以殺滅病毒(如流行性腹瀉病毒),但這只能作為緊急緩解措施,因為這要求產(chǎn)品在干燥和運輸過程中必須不存在交叉污染。實驗中我使用過熒光定量八聯(lián)管和96孔板,個人推薦96孔板。因為八聯(lián)管你需要蓋上蓋子,而且蓋子比較的難按下去,稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。有的時候一下忘記了是從哪邊開始的。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。上機器前i好離心一下,讓貼在管壁上的液體流下來同時也消掉氣泡。


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QF-PCR技術在國外已有較廣泛的應用,但目前尚未在國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。豬場一線需要快速檢測技術以盡早確診,做到早處理、早隔離,但要明確的是,豬場只需要通過合適的檢測工具,幫助“定性”即可,不需要深入定量分析,有問題直接捕殺無害化處理。為規(guī)范使用QF-PCR技術,由國家衛(wèi)生和計劃生育委i員會召集、中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主辦的"全國產(chǎn)前篩查與診斷技術管理規(guī)范編制研討會"于2015年11月14日在成都召開,會議就QF-PCR等快速產(chǎn)前診斷技術的臨床應用進展及其在國內(nèi)應用中存在的具體問題進行了深入而廣泛的探討,并形成了QF-PCR技術在產(chǎn)前診斷中的應用共識。

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熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。主要是利用磁珠純化核酸及蛋白質從而達到提取核酸的目的,在細胞、動植物組織等研究方面,一個樣品用一個探針,有效防止樣品之間的交叉污染。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理: 隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測 產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 


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定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術,即實時定量PCR。因為八聯(lián)管你需要蓋上蓋子,而且蓋子比較的難按下去,稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量,不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。

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PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.


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