柱色譜法( Column chromatography)所用色譜管為內(nèi)徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內(nèi)裝有吸附劑。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時的流速，均按各單體中的規(guī)定。吸附劑的顆粒應盡可能保持大小均勻，以保證良好的分離效果，除另有規(guī)定外通常多采用直徑為0.07-0.15mm的顆粒。吸附劑的活性或吸附力對分離效果有影響，應予注意。吸附劑的填裝 干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時使用的流動相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞，加入適量的流動相，旋開活使流動相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的流動相留在吸附層的上面。濕法：將吸附劑與流動相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。俟填裝吸附劑所用流動相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時，即加試樣溶液。試樣的加入 除另有規(guī)定外，將試樣溶于層析時使用的流動相中，再沿色譜管壁緩緩加入。以前填料純化技術(shù)不是很成熟，十八烷基鍵合到硅膠表面不是很完全，硅膠上總是少量的硅羥基在外面。注意勿使吸附劑翻起?；?qū)⒃嚇尤苡谶m當?shù)娜軇┲小Ｅc少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。洗脫 除另有規(guī)定外，通常按流動相洗脫能力大小，遞增變換流動相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變流動相的品種和比例。操作過程中應保持有充分的流動相留在吸附層的上面。

在發(fā)生“堵”的現(xiàn)象后，就需要找出原因，主要是什么位置發(fā)生了“堵”。

注意，絕大多數(shù)情況下，整個系統(tǒng)只會有一個地方發(fā)生堵塞。查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開，仔細觀察壓力數(shù)值，如果某一個部件（柱子除外）裝上和拆下時的壓力差別很大，可發(fā)展變化判斷。至于柱的堵塞，可以通過換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來判斷。

溶劑入口過濾頭

未經(jīng)過濾的溶劑或溶劑瓶中生長的微生物都會降低溶劑入口過濾頭的壽命,并影響泵性能.一般3個月清洗或更換。將溶劑入口管從過濾頭和瓶蓋組件處撥下,如果管線中充滿溶劑,當過濾頭性能良好時,溶劑會自由地從管中滴出．如果堵塞，就沒有溶劑或只有很少量的溶劑從管中滴出。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。不要使用超聲清洗溶劑入口過濾頭，否則玻璃顆?？赡苁瞧扑樵斐啥氯?。

使用儀器不當：只要互相有10%比例就不會出現(xiàn)這個問題。另一原因是在用緩沖液鹽溶液（不論甲1醇含量有多少）作流動相時，實驗結(jié)束后沒有換甲1醇水沖洗，使得微滲的流動相干燥形成晶體造成。不過，輸送泵漏液并不是非得馬上修不可，沖洗干凈并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。原因：墊圈與運動著的柱塞桿緊緊接觸，是液相色譜系統(tǒng)中易磨損的部件。檢測器漏液是個很麻煩的事，一般都是吸收池的問題，更換的費用相當高。但是并不是說一定要馬上更換，還可以從實際實驗效果看能否湊合使用。

隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8)，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的脫落。水是極性強的溶劑，在反相色譜中常常和基礎溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶1劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶1劑稱為修飾劑。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法

固定相極性 高～中 中～低

流動相極性 低～中 中～高

組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出