腺病毒包裝原理介紹

腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個 殼粒呈二十面體排列構成。染色質免l疫沉淀分析(ChIP)的基本原理是在活l細胞狀態(tài)下，當用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產(chǎn)生共價鍵。每個殼粒的直徑為7-9nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，兩端各有長約100bp的反向重復序列。人體腺病毒 已知有33種，分別命名為ad1-ad33，研究詳細得是ad2.

腺病毒是一種無包膜的球型結構的病毒，遺傳物質為線型 雙股DNA形式。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2。腺病毒的特點：（1）gan染范圍廣對人致病性低；（2）對增殖和非增殖細胞均具有gan染性；（3）能有效進行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色體中，無插入致突變性；(6)外源基因裝載容量大。由于腺病毒的這些特點使其廣泛地應用于體 外基因轉導、體內(nèi)接種yi苗、和基因zhi療等各個領域。

實驗方法

1.獲得目的基因序列；

2.構建病毒表達載體質粒；

3.表達載體質粒和包裝質粒重組；

4.gan染HEK293，包裝出病毒；

5.病毒擴增、濃縮；

6.滴度測定。

DNA測序檢測

1. PCR測序反應

(1)取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑:

所加試劑測定模板管標準對照管

BigDye Mix

1μl

待測的質粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf ( )雙鏈DNA

-1μ1

待測DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

滅菌去離子水

2μ 1

總反應體積5μ 1,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀.上進行擴增。98C變性2min后進行PCR循環(huán)，

PCR循環(huán)參數(shù)為96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 個循環(huán)，擴增結束后設置4C保溫。

2.乙醇法純化PCR產(chǎn)物

(1) 將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C離心30 min,小心棄上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗滌沉淀2次。12 000r/min 于4C離心5min,小心棄上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。

(1)加入12μ 1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

(2)將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

(3)在PCR儀上進行熱變性(95C 2min),冰中驟冷，待_上機。

4..上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立

運行的測序順序文件。

5.儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過

序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。

6.測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。

外顯子測序

外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。

如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學醫(yī)學院遺傳學系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。實驗流程：細胞收集-細胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質轉膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照結果示例：圖A不同大小的質粒轉染細胞后，Westernblot檢測圖片。該研究結果發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進行分析。他們的結 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80M測序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標序列達到10x以上的測序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。

除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。腺相關病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以滿足各類整體實驗的使用要求。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統(tǒng)的方法,是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構象的不同而使其加以分離。據(jù)估計,在人類基因組中,大約每千個堿基中有一個SNP,無論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標記(STR),都要廣泛得多。由于在動態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲l基化水平。該方法由Ruo等1980年首l次報道。過程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5 mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。這是一種檢測DNA甲l基化水平的標準方法。

2.高l效毛細管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細管來從復合物中分離不同化學組分的技術。往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s，冰上靜置12min[問l。其基礎是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結構以及疏水性等不同而相互分開。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來確定5mC水平，簡便，經(jīng)濟且敏感性高。