PCR法不僅僅局限于分子生物學(xué)，還因其簡(jiǎn)便、迅速等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)、動(dòng)植物檢驗(yàn)等其它領(lǐng)域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應(yīng)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克1隆、變異導(dǎo)入等實(shí)驗(yàn)中，需加以注意。

2. 擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度：使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，通常可擴(kuò)增幾kb的DNA，超過(guò)10 kb則比較困難。這就給利用PCR進(jìn)行Mapping等Genome解析帶來(lái)麻煩。

3. 擴(kuò)增量：使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR產(chǎn)物克1隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)等時(shí)，擴(kuò)增量常常達(dá)不到要求。為解決以上難題，Takara在對(duì)Polymerase、Buffer及反應(yīng)條件等進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術(shù)，運(yùn)用此技術(shù)可大量正確地?cái)U(kuò)增長(zhǎng)達(dá)40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技術(shù)擴(kuò)展了PCR的應(yīng)用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長(zhǎng)片段 DNA的克1隆及變異導(dǎo)入等方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。

LA PCR的原理

LA PCR的關(guān)鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過(guò)程中當(dāng)有錯(cuò)誤的堿基攝入時(shí)，反應(yīng)性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯(cuò)配的堿基除去，從而延伸反應(yīng)能順利地進(jìn)行下去，使長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增成為可能。

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

復(fù)合PCR(multiplex PCR)技術(shù)

在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段.如果基因的某一區(qū)段有缺失則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會(huì)消失。復(fù)合PCR主要用于同一病原體的分型及同時(shí)檢測(cè)多種病原體、多個(gè)點(diǎn)突變的分子病的診斷。

重組PCR技術(shù)

重組PCR技術(shù)是在兩個(gè)PCR擴(kuò)增體系中,兩對(duì)引物分別由其中之一在其5°-端和3-端引物上帶.上一段互補(bǔ)的序列混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.經(jīng)變性和復(fù)性。兩組PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連。其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)包含兩個(gè)不同基因的雜合基因。