細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；管底的細(xì)胞團(tuán)不要打散，沿管壁倒入適量(一般為材料體積的5-10倍)的2。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。

細(xì)胞檢測(cè)服務(wù)

作為生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，細(xì)胞在機(jī)體的各項(xiàng)新陳代謝的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，與此同時(shí)，細(xì)胞的生理過程，在一定程度上也是機(jī)體生命活動(dòng)的反應(yīng)。因此利用多種精密儀器，結(jié)合特異性的檢測(cè)試劑，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接檢測(cè)其增殖的基本過程，或?qū)?xì)胞進(jìn)行不同的處理后檢測(cè)細(xì)胞生活周期內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)的變化，從而深入揭示細(xì)胞新陳代謝的具體機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。

BrdU染色原理

 BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標(biāo)記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細(xì)胞中新合成的DNA中(細(xì)胞周期S期)。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA進(jìn)入子細(xì)胞中BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和調(diào)亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。

注射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu,以氫鏈與腺呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG孵育、



呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細(xì)胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養(yǎng)皿) 培養(yǎng) 24 小時(shí)，使其達(dá)到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在 1 mL 無 DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質(zhì)粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉(zhuǎn) 1 秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3) 棄去細(xì)胞中的舊液，用 1 mL 無 DMEM 洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃ 培養(yǎng) 3～5 小時(shí)。

(4) 再于每孔中加入 20?S 的 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 14～24 小時(shí)，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮 10?S 的 DMEM，2 mL/孔，再培養(yǎng) 24～48 小時(shí)。

(6) 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1) 接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至 50% 板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20?S 的 DMEM，37℃ 培養(yǎng) 48 小時(shí)。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。