動物細胞培養(yǎng)

高速冷凍離心機在所有的細胞離體培養(yǎng)中，困難的是動物細胞培養(yǎng)。下面是它所需要的特殊條件。

⑴血1清：動物細胞離體培養(yǎng)常常需要血1清。相對常用的是小牛血1清。血1清提供生長必需因子，如激1素、微量元素、礦物質和脂肪。在這里，血1清等于是動物細胞離體培養(yǎng)的天然營養(yǎng)液。

⑵支持物：大多數(shù)動物細胞有貼壁生長的習慣。離體培養(yǎng)常用玻璃，塑料等作為支持物。

⑶氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細胞培養(yǎng)過程中不斷進行調節(jié)，不斷維持所需要的氣體條件。

環(huán)境條件

無菌環(huán)境：無毒和無菌是體外培養(yǎng)細胞的首要條件。細胞在活1體內，解1毒系統(tǒng)和免1疫系統(tǒng)可抵抗微生物或其他有害物質的侵入，但細胞在體外培養(yǎng)的過程中，缺乏機體免1疫系統(tǒng)的保護而喪失對微生物的防御能力和對有害物質的解1毒能力。為保證細胞能在體外環(huán)境中生長繁殖，必須要確保無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。

常見的微生物污染有支原體、細菌、真菌。支原體無致死毒性，可與細胞長期共存，對細胞有潛在影響，但體積小，不易鑒別，可借助于地衣紅或Hoechst33342染色來進行檢測。細菌增殖快，在短時間內即可大量擴增，并產(chǎn)生毒1素殺1死細胞。真菌的種類繁多，肉眼可見，漂浮于培養(yǎng)液面上，可呈絲狀、管狀或樹枝狀等。

細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25?TA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進行計數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。