熒光定量PCR儀的相關(guān)介紹

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR 中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測(cè)PCR反應(yīng)的終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。

在real-time Q-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲 線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板當(dāng)初的含量。

熒光定量PCR儀的產(chǎn)前診斷應(yīng)用

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到目前為止，人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測(cè)，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。

熒光定量PCR的原理

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PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步?；蛘呤褂脽晒馊玖蟂YBR。SYBR可以結(jié)合到雙鏈DNA上面，當(dāng)體系中的模板被擴(kuò)增時(shí)，SYBR可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進(jìn)行，結(jié)合的SYBR染料越來越多，被儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)越來越強(qiáng)，從而達(dá)到定量的目的。