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冷凍食品加工廠熒光定量PCR高性價(jià)比的選擇【勱博儀器】

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發(fā)布時(shí)間:2021-01-21 20:24  






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在real-time Q-PCR技術(shù)中,無(wú)論是相對(duì)定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問(wèn)題有待解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中,標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個(gè)必不可少的過(guò)程。廣州勱博--冷凍食品加工企業(yè)/公司/廠核酸提取純化QF-PCR技術(shù)在國(guó)外已有較廣泛的應(yīng)用,但目前尚未在國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開(kāi)展。目前由于無(wú)一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同,致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性。此外,用real-time Q-PCR來(lái)研究mRNA時(shí),受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對(duì)定量中,其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實(shí)驗(yàn)條件的影響的,合理地選擇合適的不受實(shí)驗(yàn)條件影響的內(nèi)源控制物也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。

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與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,Real-time Q-PCR的不足之處是:(1)由于運(yùn)用了封閉的檢測(cè),減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)步驟,因此也就不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小;(2)因?yàn)闊晒馑胤N類以及檢測(cè)光源的局限性,從而相對(duì)地限制了real-time Q-PCR的復(fù)合式(multiplex)檢測(cè)的應(yīng)用能力;(3)目前real-time Q-PCR實(shí)驗(yàn)成本比較高,從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。在real-timeQ-PCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào),隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。


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非洲為何難以控制?非洲病毒基因組全長(zhǎng) 170~190 kb,為有囊膜的雙鏈 DNA 病毒,病毒粒子大小為 175~215 nm,呈正二十面體結(jié)構(gòu),也是唯i一的蟲(chóng)媒DNA病毒?;蛘吒鶕?jù)實(shí)際情況,在生豬進(jìn)場(chǎng)前以生豬運(yùn)輸車輛為單位采集全部生豬血液樣品,混合后進(jìn)行檢測(cè)。非洲病毒是一種急性、熱性、高度接觸性傳i染病,引起豬的死i亡率可達(dá)100%,并且非洲具有潛伏期,即使感i染病毒,但沒(méi)有臨床癥狀,就有可能通過(guò)非實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)關(guān)卡流入市場(chǎng),進(jìn)而導(dǎo)致下游食品企業(yè)相關(guān)問(wèn)題的出現(xiàn)。

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非洲與傳統(tǒng)相似且綜合癥狀復(fù)雜難辨,臨床上類似于急性,表現(xiàn)為高熱、皮膚充血、流i產(chǎn)、水腫和臟器出血。我國(guó)因之前不屬于非洲i疫情國(guó)家,因此沒(méi)有相關(guān)的針對(duì)性研究,目前采用的是原農(nóng)i業(yè)部檢疫所于1997年與美國(guó)梅島動(dòng)物病研究所共同研究的檢測(cè)方法,主要是PCR和ELISA,標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T 18648-2002非洲診斷技術(shù)。研究表明熱工過(guò)程可以殺滅病毒(如流行性腹瀉病毒),但這只能作為緊急緩解措施,因?yàn)檫@要求產(chǎn)品在干燥和運(yùn)輸過(guò)程中必須不存在交叉污染。隨著相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)于非洲的檢測(cè)方法也更加完善。PCR技術(shù)是目前i簡(jiǎn)單、快速的分子學(xué)檢測(cè)方法,但該方法的敏感性有限,因此以PCR為基礎(chǔ)的更新方法應(yīng)運(yùn)而生。


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隨著定量PCR儀設(shè)計(jì)上的不斷改進(jìn),對(duì)溫度控制的精密性越來(lái)越高,出現(xiàn)了像Rotor-Gene這樣的管間溫度均一性達(dá)±0.01℃的定量PCR儀,而該公司新近推出的Rotor-Gene6000更可達(dá)到±0.02℃的溫度分辨率。溫度上的高分辨率使得運(yùn)用定量PCR儀進(jìn)行高分辨率熔解曲線(HRM)分析基因型成為可能。專門的熱循環(huán)儀配備熒光檢測(cè)模塊,用于監(jiān)測(cè)擴(kuò)增時(shí)的熒光,檢測(cè)到的熒光信號(hào)反映了每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。高分辨率熔解曲線根據(jù)序列長(zhǎng)度、GC含量和互補(bǔ)性分析樣品。不同的核酸序列,哪怕僅有一個(gè)堿基的差異,也會(huì)體現(xiàn)在熔解溫度的差別上。

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PCR是1985年開(kāi)始出現(xiàn)的一項(xiàng)基因檢測(cè)技術(shù),由于PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便易行、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究,成為分子生物學(xué)必不可少的研究工具。但在許多情況下,研究者們已不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否,他們更著眼于對(duì)其進(jìn)行精i確的核酸定量。根據(jù)應(yīng)對(duì)流行性腹瀉病毒的經(jīng)驗(yàn),在不影響動(dòng)物性能和飼料成本的情況下,替換原料的可行性使得很多生產(chǎn)者不再使用豬源原料。因而,借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確的定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR( real-time quantitative PCR, RQ PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。


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