限制酶的限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源DNA ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。Methylation是常見(jiàn)的修飾作用，可使腺piao呤A和胞嘧1啶C Methylation而受到保護(hù)。通過(guò)甲1基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。

所以，能產(chǎn)生防御病毒侵染的限制酶的細(xì)菌，其自身的基因組中可能有該酶識(shí)別的序列，只是該識(shí)別序列或酶切位點(diǎn)被Methylation了。但并不是說(shuō)一旦Methylation了，所有限制酶都不能切割。大多數(shù)限制酶對(duì)DNAMethylation敏感，因此當(dāng)限制酶目標(biāo)序列與Methylation位點(diǎn)重疊時(shí)，對(duì)酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。

對(duì)MethylationDNA的切割能力是限制酶內(nèi)在和不可預(yù)測(cè)的特性，因此，為有效的切割DNA，必須同時(shí)考慮DNA Methylation和限制酶對(duì)該類型Methylation的敏感性。另外，大部分商業(yè)限制酶如今專門用于切割Methylation DNA。

DNA限制性內(nèi)切酶酶切是一項(xiàng)基于DNA限制性內(nèi)切酶的基因工程技術(shù)，其基本原理是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA上特定序列的識(shí)別，來(lái)確定切割位點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)切割，從而獲得所需的特定序列。

生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來(lái)的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的DNA卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。

質(zhì)粒載體和外源ＤＮＡ中限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)

    如今，質(zhì)粒載體中限制酶切位點(diǎn)的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點(diǎn)恰恰與外源ＤＮＡ部分片段本身毫無(wú)二致的載體。這就具備一個(gè)不可1比擬的優(yōu)點(diǎn)，也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如，識(shí)別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開(kāi)。然而很多清況下，用切點(diǎn)位于多克1隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化，可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，不可能找到“門當(dāng)戶對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決：

   1）在線狀質(zhì)粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。

   2）在得到控制的反應(yīng)條件下，用大腸桿1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補(bǔ)平帶3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所討論，這樣?？梢允鼓切┎幌嗥ヅ涞南拗泼盖形稽c(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端，從而促進(jìn)載體和外源ＤＮＡ的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平的反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力，故連接反應(yīng)過(guò)程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低

限制性內(nèi)切酶的質(zhì)量控制鑒定

限制性內(nèi)切酶的一個(gè)活性單位是指，在50μl 的反應(yīng)體系里，采用隨酶提供的 NEBuffer，用1個(gè)小時(shí)的時(shí)間，徹底消化1μg底物DNA所需要的酶量。酶切反應(yīng)應(yīng)在帶蓋的eppendorf 管中進(jìn)行，選用技術(shù)數(shù)據(jù)卡上所標(biāo)明的適宜溫度。在確定酶活性之前，濃縮的酶應(yīng)該用推薦的貯存液稀釋成大約1,000 單位/ml。

質(zhì)量控制

所有質(zhì)量控制鑒定結(jié)果都公布在隨酶提供的技術(shù)數(shù)據(jù)卡上。