小G蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族，它在細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種， Cdc42參與生理活動過程中其分子結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)出2種相互轉(zhuǎn)換的形式：與GTP結(jié)合的激l活狀態(tài)和與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)。

目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行Cdc42活性l功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結(jié)合蛋白與p21結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測方法的重復(fù)性較差。

儲存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于4°C條件下保存。

試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實(shí)驗(yàn)者自行配置）

1.  刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l劑；

3.  4 °C 搖桿或者搖床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  電泳和免l疫印跡相關(guān)試劑；

8.  免l疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纖維素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 檢測試劑；

體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對照

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有10%的Cdc42被激l活，而在體外用GTPγS處理大約有90%的Cdc42被激l活。

1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入0.5 mL的細(xì)胞提取物（如果是純的Cdc42蛋白則每個管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個管中加入20ul 0.5M EDTA(終濃度即為20 mM)。

3. 一個管中加入5ul的100X GTPγS（終濃度即為100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入5ul的100X GDP（終濃度即為1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于30°C條件下反應(yīng)30min并不斷攪動。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為60mM)。

檢測步驟

Ι?；钚訡dc42 Pull-Down實(shí)驗(yàn)

1. 等分0.5-1 mL的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 緩沖液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42單克l隆抗l體。

4. 用渦旋振蕩儀將protein A/G凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

5. 將管置于4°C條件下孵育1H，并輕輕的進(jìn)行搖動。

6. 5000g，離心1分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸5min。

12. 5000g，離心10s。