Elisa試劑盒操作步驟

1、固相載體的挑選：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。

2、包被或抗原的挑選：將或抗原吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。

3、 酶標記作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法'，在正式試驗體系里準確地滴定其作業(yè)濃度。

4、酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。

Elisa試劑盒操作注意事項

1．Elisa試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以讀數(shù)為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按污染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

Elisa試劑盒——Elisa實驗常見問題及解決方案

顯色淡，靈敏度偏低

1  試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）

2  樣品不適合做ELISA檢測 樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優(yōu)化檢測的條件（例如稀釋液的成分）

3  酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥 防止板過于干燥

4  包被遭到破壞 操作溫和，移液槍不能碰到孔底

5  樣本和孵育條件不合適 按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。

6  洗滌浸泡時間過長 按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間；

7  偶聯(lián)HRP試劑污染 棄去試劑，重新配置

8  錯誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑 棄去試劑，重新配置

9  TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時間 確定合適的孵育時間：人為判定-高濃度的標準品出現(xiàn)深藍色；S4-5有淡藍色；機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65

10  樣本濃度過高或存在基質(zhì)效應(yīng) 建議做不同稀釋倍數(shù)，確認樣本稀釋倍數(shù)。

11  濾光片設(shè)置有問題或者波長選擇不對 確認儀器設(shè)置及選擇正確的波長檢測。

12  酶標板不適合做ELISA 不能使用細胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA高吸附力板子。

不正常的標準曲線

1  錯誤的方法重懸標準品  加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分

2  標準品稀釋錯誤  按照說明書要求稀釋標準品

3  標準品污染  使用一次性的滅菌吸頭， 標準品貯存于2-8 ℃

4  錯誤的倍比稀釋步驟  按照說明書倍比稀釋標準品

5  波長選擇錯誤 TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優(yōu)于單波長。

6  標準品混用  不同批號試劑勿混用

7  試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活  盡量縮短運輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

8  ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測，否則會出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。（數(shù)值仍有梯度規(guī)律）