Elisa試劑盒操作步驟

1、固相載體的挑選：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。

2、包被或抗原的挑選：將或抗原吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。

3、 酶標(biāo)記作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法'，在正式試驗(yàn)體系里準(zhǔn)確地滴定其作業(yè)濃度。

4、酶的底物及供氫體的挑選：對(duì)供氫體的挑選要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。

Elisa試劑盒操作注意事項(xiàng)

1．Elisa試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按污染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

Elisa試劑盒——Elisa實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

顯色淡，靈敏度偏低

1  試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）

2  樣品不適合做ELISA檢測(cè) 樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測(cè)或者需要優(yōu)化檢測(cè)的條件（例如稀釋液的成分）

3  酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時(shí)過(guò)分干燥 防止板過(guò)于干燥

4  包被遭到破壞 操作溫和，移液槍不能碰到孔底

5  樣本和孵育條件不合適 按照說(shuō)明書(shū)條件，建議孵育過(guò)程中全程振蕩孵育。

6  洗滌浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 按照說(shuō)明書(shū)操作。勿人為增加浸泡時(shí)間；

7  偶聯(lián)HRP試劑污染 棄去試劑，重新配置

8  錯(cuò)誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑 棄去試劑，重新配置

9  TMB底物孵育時(shí)間過(guò)短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時(shí)間 確定合適的孵育時(shí)間：人為判定-高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色；S4-5有淡藍(lán)色；機(jī)器判定620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值達(dá)到0.6-0.65

10  樣本濃度過(guò)高或存在基質(zhì)效應(yīng) 建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本稀釋倍數(shù)。

11  濾光片設(shè)置有問(wèn)題或者波長(zhǎng)選擇不對(duì) 確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長(zhǎng)檢測(cè)。

12  酶標(biāo)板不適合做ELISA 不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA高吸附力板子。

不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1  錯(cuò)誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品  加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分

2  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤  按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

3  標(biāo)準(zhǔn)品污染  使用一次性的滅菌吸頭， 標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃

4  錯(cuò)誤的倍比稀釋步驟  按照說(shuō)明書(shū)倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

5  波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤 TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm。雙波長(zhǎng)比色分析優(yōu)于單波長(zhǎng)。

6  標(biāo)準(zhǔn)品混用  不同批號(hào)試劑勿混用

7  試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活  盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

8  ELISA未終止而直接檢測(cè)450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測(cè)，否則會(huì)出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。（數(shù)值仍有梯度規(guī)律）