pcr擴(kuò)增的原理

實(shí)驗(yàn)方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留copy原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)1制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)1制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)步驟，通過將這一套過程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬倍的擴(kuò)增。

LA PCR的原理

LA PCR的關(guān)鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過程中當(dāng)有錯(cuò)誤的堿基攝入時(shí)，反應(yīng)性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯(cuò)配的堿基除去，從而延伸反應(yīng)能順利地進(jìn)行下去，使長鏈DNA的擴(kuò)增成為可能。

隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù)(arbitrary primedPCR, AP- PCR)

AP-PCR技術(shù)通過隨意設(shè)計(jì)或選擇一個(gè)非特異性引物.在PCR反應(yīng)體系中.首先在不嚴(yán)格條件下使引物與模板中許多序列通過錯(cuò)配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在,則可經(jīng)Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生DNA部分片段的擴(kuò)增。經(jīng)一至數(shù)輪不嚴(yán)格條件下的PCR循環(huán)后，再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序凝膠電泳分離后.經(jīng)放1射性自顯影或熒光顯示即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫1瘤的抑制基因、癌基因的分離;菌1種、菌株及不同物種的鑒定;遺傳作圖;不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達(dá)差異等方面的研究。

競爭性PCR(competitive PCR, c-PCR技術(shù)

c-PCR技術(shù)是競爭cDNA模板與目的cDNA同時(shí)擴(kuò)增.使用同樣的引物,但一經(jīng)擴(kuò)增后。能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板.其序列與目的cDNA序列相同.不過模板中僅有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)或缺少內(nèi)切位點(diǎn)突變性的cDNA模板可用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶水解,并用分光計(jì)測(cè)定其濃度。cDNA目的序列和競爭模板相對(duì)應(yīng)的含量.可用澳化乙錠染色.電泳膠直接掃描進(jìn)行測(cè)定或摻入放1射性同位素標(biāo)記的方法測(cè)定。競爭模板開始時(shí)的濃度是已知的.則cDNA目的序列的zui初濃度就能測(cè)定。這種方法能準(zhǔn)確測(cè)定mRNA中cDNA靶序列.可用于幾個(gè)到10個(gè)細(xì)胞中mRNA的定量。