PCR循環(huán)參數(shù)

預變性模板DNA完全變性與PCR酶的完全激1活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激1活時間為兩分鐘。 

變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。 

引物退火：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

引物延伸：引物延伸一般在72℃進行（Taq酶zui適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。

zui后延伸在zui后一個循環(huán)后，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

原位PCR( in situ PCR)技術

原位PCR綜合了PCR和原位雜交( Insitu hybridization, ISH)的優(yōu)點是一種在組織切片或細胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進行擴增.再用特異性的探針原位雜交檢測。原位PCR標本一般需先經(jīng)化學固定,以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜有一定的通透性,PCR擴增所需的各種成分可進入細胞內或核內。在原位對特定的DNA或RNA進行擴增。擴增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過細胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應用ISH將其檢出,同時還可對目的DNA序列的組織細胞進行形態(tài)學分析。

突變：PCR克1隆的一大優(yōu)點是能夠通過克1隆將所需突變引入目的基因中，以便進行突變研究。在 定1點突變中，經(jīng)過設計的PCR引物可將堿基置換、刪除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克1隆至質粒中的序列上。隨后，含有引入突變的PCR產(chǎn)物通過自我連接，重新生成環(huán)狀質粒，并用于轉化感受態(tài)細胞。

測序：PCR是為測序富集模板DNA的一種相對簡單的方法。為保證DNA序列準確性，強烈建議使用高保真PCR來制備測序模板。在 Sanger測序中，PCR擴增片段經(jīng)純化并用于測序反應。使用常用的測序引物結合位點對PCR引物的 5′末端進行標記，以簡化測序工作流程。

         二代測序 （NGS）中，PCR被廣泛用于構建DNA測序文庫。在NGS文庫制備中，DNA樣品通過PCR反應富集（在起始量有限的情況下）并使用adaptor（以及用于多重檢測的index）標記。除了具有高保真度，DNA聚合酶還應具有zui小的擴增偏好性，從而使測序文庫具有高覆蓋度。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常12鐘溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。

工作模式和原理同普通PCR儀一樣，它出了又普通PCR儀的功能外還多了一個梯度退火功能。DNA部分片段的擴增對溫度的控制精度要求特別高，不同的DNA部分片段其退火溫度不一樣，通過計算DNA部分片段中的CG堿基的含量只能初步的判斷出zui優(yōu)退火溫度在 5℃范圍內，如果用普通PCR儀進行研究，需重復擴增很多次，然后做電泳進行分析來確定zui優(yōu)退火溫度。而梯度PCR儀則只需要一次就可以完成，在節(jié)省了時間的同時提高了實驗的可靠性和準確性。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間和經(jīng)費。在不設置梯度的情況下，梯度PCR儀也可以做普通PCR擴增。

該儀器主要應用于科研，教學機構，醫(yī)學臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。