細(xì)胞增殖檢測(cè)

     本公司應(yīng)用MTT比色法， 檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。其檢測(cè)原理為huo細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸脫氫酶能催化外源性無(wú)色的MTT形成藍(lán)色的結(jié)晶Formazan，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的Formazan，用酶聯(lián)mian疫檢測(cè)儀在一定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映huo細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。常用的染色法包括臺(tái)盼藍(lán)、橙/化乙啶（AO/EB）、Giemsa和HE法等。

     該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫liu藥wu篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、以及腫liu放she敏感性測(cè)定等。服務(wù)內(nèi)容      1. 細(xì)胞接種：收到客戶細(xì)胞后，我們會(huì)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞懸液濃度。計(jì)算出應(yīng)稀釋的倍數(shù)，按MTT試劑盒要求在96孔板內(nèi)接種 相應(yīng)濃度的細(xì)胞懸液；7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。

     2. 細(xì)胞培養(yǎng)：然后在無(wú)菌恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)接種好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)；  

     3. yao物處理并呈色：按不同濃度梯度加入yao物作用細(xì)胞；

     4. 溶解，比色：加入MTT檢測(cè)試劑，按操作要求孵育相應(yīng)時(shí)間，在mei標(biāo)儀內(nèi)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光值。并處理數(shù)據(jù)得出比色結(jié)果。

軟gu細(xì)胞培養(yǎng)

(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無(wú)菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)(保留周?chē)∪猓沢u不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺(tái)，剔除關(guān)節(jié)周?chē)街能浗M織，打開(kāi)髖、膝關(guān)節(jié)，用尖刀削取關(guān)節(jié)軟gu組織，置入裝有PBS緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿，防止軟gu組織被風(fēng)干。同時(shí)還可以使用獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行專(zhuān)利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面的申請(qǐng)審批。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，將細(xì)小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min,收集細(xì)胞(沉淀物),加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細(xì)胞混懸液。2)陽(yáng)性CD117(c-kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來(lái),并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試。

(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照保存。

BrdU染色原理

 BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標(biāo)記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細(xì)胞中新合成的DNA中(細(xì)胞周期S期)。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA進(jìn)入子細(xì)胞中BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞組技術(shù)人員畢業(yè)于東南大學(xué)、華中科技大學(xué)等高校生物學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)，具有碩士研究生以上學(xué)歷，熟練掌握細(xì)胞學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可開(kāi)展多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

注射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類(lèi)，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無(wú)內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu,以氫鏈與腺呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG孵育、



呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。