小鼠精原gan細胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個細胞,其中約有 2×104個是精原gan細胞,僅占gao丸生精上皮細胞總數(shù)的 0.02～0.03%,精原gan細胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細胞,再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來,并在體外進行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%,CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%, 二者都陽性細胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%,CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%,二者都陽性細胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1),CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子,percoll離心后細胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細胞純度

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數(shù)細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

細胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

霉菌污染

正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見絲狀和團塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，雖然細胞仍在生長，但它們的生命狀態(tài)會在長時間后逐漸惡化。

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉(zhuǎn)移所有細胞，并立即徹底使用 guo 氧擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當(dāng)于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。將 guo 氧放在培養(yǎng)箱中一小時，使蒸汽擴散，待 guo 氧氣味消散后，將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

線菌素 D 或青鏈。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述，也沒有什么區(qū)別。對于支原體污染的細胞培養(yǎng)，選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，徹底消毒環(huán)境。如果所有的細胞都被污染了，那可能是整個培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG孵育、呈色，顯示進入S期細胞的情況。因此，必須對培養(yǎng)基和實驗設(shè)備進行檢查。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實驗操作步驟的規(guī)范。