低溫生物菌種——制備

也稱(chēng)種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。種子制備包括孢子制備和菌絲體制備（見(jiàn)圖），其中(1)～(4)為孢子制備過(guò)程。保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種，用無(wú)菌手續(xù)挑取少許，接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25℃（或較高溫度）下培養(yǎng)5～7天(或較長(zhǎng)時(shí)間)。所得孢子還需進(jìn)一步用較大表面積的固體培養(yǎng)基以獲得更多孢子，對(duì)于霉菌類(lèi)孢子制備，多數(shù)采用大米、小米之類(lèi)的天然培養(yǎng)基。將培養(yǎng)成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于25～28℃培養(yǎng)14天。將成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中備用。一次制得的孢子瓶可在生產(chǎn)上延續(xù)使用半年左右。菌孢子的培養(yǎng)基大多是采用麩皮或豌豆浸出液、牛肉膏及無(wú)機(jī)鹽與瓊脂制成的。將斜面孢子接入擴(kuò)大的扁瓶孢子培養(yǎng)基中,于28～37℃培養(yǎng)5～14天。所獲得的大量孢子可直接作為種子罐 (6)的種子。如果有些生產(chǎn)菌種不產(chǎn)孢子，如產(chǎn)生菌或產(chǎn)孢子不多的,則可采用搖瓶（5）液體培養(yǎng)制得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發(fā)芽、生長(zhǎng)、繁殖成大量菌體。其中的培養(yǎng)基組分應(yīng)是易于被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿等）,及無(wú)機(jī)鹽(如磷酸鹽)等。作為發(fā)酵罐(7)的種子應(yīng)是生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯,無(wú)雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。

低溫生物菌種的發(fā)展趨勢(shì)

生產(chǎn)成本低、應(yīng)用效果好

我國(guó)長(zhǎng)期大量施用化肥，使單位化肥量的增產(chǎn)量下降，因此有效合理施用化肥，提高化肥利用率已成為一個(gè)重要課題。因此，增加有機(jī)肥、微生物肥料的施用不再是權(quán)宜之計(jì)，而是降低農(nóng)民投入，提高產(chǎn)品品質(zhì)、減少環(huán)境污染，取得較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益的一項(xiàng)有效措施。

生產(chǎn)無(wú)公害食品、減少環(huán)境污染的需求

無(wú)公害食品對(duì)當(dāng)今的農(nóng)業(yè)提出了更高的要求。人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量也提出來(lái)更高的要求。隨著國(guó)內(nèi)外積極發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)(生態(tài)農(nóng)業(yè))，生產(chǎn)安全、無(wú)公害的食品成為一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，這就為開(kāi)發(fā)生產(chǎn)好品質(zhì)的微生物肥料提供一個(gè)好的發(fā)展機(jī)遇。并且由于濫用化肥引起的土壤質(zhì)量下降，地下水污染等問(wèn)題日益突出，無(wú)污染的微生物肥料的綜合作用更顯示出它的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和良好的發(fā)展前景 。

低溫生物菌種——常用菌種介紹

側(cè)孢芽孢菌

在延遲期， 短芽孢菌為革蘭氏染色陰性，菌體呈細(xì)長(zhǎng)的桿狀；在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，為革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體成短而粗的桿狀；在靜止期，革蘭氏染色又轉(zhuǎn)為陰性，菌體成細(xì)長(zhǎng)的桿狀，偶爾也能觀察到橢圓形的芽孢。圖1是50號(hào)菌用1%H2SO4(pH6.8)負(fù)染后的電鏡照片：菌體桿狀、周生鞭毛、大小約0.88μm×2.2μm。

作為非脊椎動(dòng)物的病原菌，有關(guān)研究人員曾報(bào)道了這種細(xì)菌的殺線蟲(chóng)能力，由于所報(bào)道的這些側(cè)孢短芽孢菌菌株都不產(chǎn)生伴孢晶體，所以這些菌株的殺線蟲(chóng)毒力因子并非來(lái)自于具有特征性的伴孢晶體。然而，Smirnova TA，et al.分離到了2株能形成大的伴孢晶體的側(cè)孢短芽孢菌菌株，這兩株菌顯示出很強(qiáng)的殺昆蟲(chóng)能力，研究證實(shí)，這種能力與菌體在形成芽孢過(guò)程中的伴孢晶體相關(guān)。有趣的是，Singer的實(shí)驗(yàn)表明，一株側(cè)孢短芽孢菌的殺線活性源于一個(gè)熱穩(wěn)定蛋白的毒性。所有這些研究表明，不同側(cè)孢短芽孢菌菌株擁有不同的線蟲(chóng)致病因子。牛秋紅研究小組分離到的側(cè)孢短芽孢菌G4菌株具有顯著的殺線蟲(chóng)功能，但其并不產(chǎn)生伴孢晶體。從該菌株的發(fā)酵液里提取的粗蛋白酶液在12h內(nèi)能殺掉所有測(cè)試線蟲(chóng)并在24h內(nèi)完全降解。從側(cè)孢短芽孢菌G4菌株中純化出的絲氨酸胞外蛋白酶可水解多種底物，包括膠原和線蟲(chóng)體壁，具有很強(qiáng)的殺線蟲(chóng)能力，組織病理電鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種蛋白酶嚴(yán)重破壞了線蟲(chóng)體壁。而且，蛋白酶將線蟲(chóng)體壁分解成為一些氨基酸或小肽，這些營(yíng)養(yǎng)物使病原細(xì)菌更好的生長(zhǎng)繁殖。該蛋白酶基因異源表達(dá)的菌株表現(xiàn)出了明顯的殺線蟲(chóng)活性，重組蛋白酶在體外對(duì)線蟲(chóng)體壁降解，而蛋白酶缺失菌株喪失了大部分的殺線活性，死的線蟲(chóng)在生測(cè)中保持了完整的體壁，表明蛋白酶在線蟲(chóng)侵染中起主要作用。