細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分設(shè)備圖片

公司目前擁有多項(xiàng)產(chǎn)品及技術(shù)，其中發(fā)明兩項(xiàng)，軟件著作權(quán)八項(xiàng)，實(shí)用新型三項(xiàng)，商標(biāo)兩件。公司先后獲得“江蘇省民營(yíng)科技企業(yè)”、“江蘇省科技型中小企業(yè)”、“江蘇省專精特新中小企業(yè)”等榮譽(yù)資質(zhì)，連續(xù)多年被評(píng)為“東南大學(xué)國(guó)家大學(xué)科技園企業(yè)”。貼壁細(xì)胞:先倒出培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶消化或者用細(xì)胞刮(會(huì)產(chǎn)生碎屑)刮下:帶培養(yǎng)液進(jìn)行離心，100-1500/mim510min。2019年公司成為江蘇省生物技術(shù)協(xié)會(huì)第七屆理事會(huì)的特邀理事，成立了“李冬冬創(chuàng)新工作室”，并獲得了南京市“工人先鋒號(hào)”的榮譽(yù)稱號(hào)。

 細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過(guò)夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過(guò)250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；2)陽(yáng)性CD117(c-kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來(lái),并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。

三、自噬過(guò)程進(jìn)行觀察和檢測(cè)

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月?tīng)罨虮瓲?，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。其檢測(cè)原理為huo細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸脫氫酶能催化外源性無(wú)色的MTT形成藍(lán)色的結(jié)晶Formazan，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來(lái)示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了此技術(shù)。共培養(yǎng)-定時(shí)間后進(jìn)行破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測(cè)，并進(jìn)一步采用RT-PCR對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶。無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: LC3對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性。(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

大鼠gu髓間充質(zhì)gan細(xì)胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無(wú)菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無(wú)菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞。

(4 )緩慢將細(xì)胞懸液加入預(yù)先裝有5mL淋巴細(xì)胞分離液的15mL離心管內(nèi)，保持細(xì)胞懸液在淋巴細(xì)胞分離液上層，注意不要攪動(dòng)液面,保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質(zhì)細(xì)胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

( 7 ) 24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液(看細(xì)胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，-般10d細(xì)胞生長(zhǎng)融合。

(8 )經(jīng)0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。