miRNA測序

microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。miRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時序性。miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測序技術(shù)?；诘诙鷾y序技術(shù)的miRNA測序，可以一次獲得數(shù)百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達(dá)差異，為研究miRNA對細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。

蛋白提取

大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液, 少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丁醇等有ji溶劑中，因些，可 采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

(一)水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶 解，縮短提取時間。但另一方面. ,溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活,因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫( 5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。

腺相關(guān)病毒包裝原理

腺相關(guān)病毒( adeno-associated virus, AAV)是一類細(xì)小病毒, 基銦組為單鏈DNA ,對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有g(shù)an染能力。通常需要腺病毒或皰zhen病毒幫助其在體內(nèi)fu制擴(kuò)增。重組腺相關(guān)病毒( recombinant AAV, rAAV )是利用AAV2型基因組與不同xue清型的衣殼蛋白基因組結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體,可將目的基因的CDS區(qū)序列或者RNAi干擾序列插入rAAV表達(dá)質(zhì)粒中,包裝病毒后gan染細(xì)胞完成對目的基因的操作。腺相關(guān)病毒具有g(shù)an染溫和,免yi原性小,長效穩(wěn)定表達(dá)的特點,主要應(yīng)用于動物體內(nèi)注射。源井生物提供的腺相關(guān)病毒顆粒經(jīng)過超su離心純化,并通過qPCR對病毒基因拷貝進(jìn)行滴定。腺相關(guān)病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以滿足各類整體實驗的使用要求。

RIP

技術(shù)概述

RIP是研究體內(nèi)蛋白與RNA互作的重要技術(shù)。該技術(shù)先用甲醛等試劑交聯(lián)細(xì)胞內(nèi)的“蛋白-RNA”互作復(fù)合物，裂解細(xì)胞后，用靶蛋白特異的抗l體(或標(biāo)簽抗l體)做免l疫沉淀，獲得“靶蛋白-RNA”互作復(fù)合物，去交聯(lián)分離其中的RNA;針對預(yù)測的靶蛋白結(jié)合RNA的序列設(shè)計引物，

做qPCR實驗，驗證預(yù)測的RNA是否與靶蛋白有結(jié)合，或者將分離出來的RNA做高通量測序，篩選到可能與靶蛋白結(jié)合的RNA。

技術(shù)流程

細(xì)胞交聯(lián)-→細(xì)胞裂解-→免l疫共沉淀→去交聯(lián)→RNA分離→建庫→高通量測序(或qPCR)。