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ELISA試劑盒的測(cè)試要求
做好對(duì)照
正式試驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,說(shuō)明有非特異性反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)條件的選擇
在ELISA中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括:
(1)固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被(或抗原)的選擇:將(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1~10μg/ml。
(3)酶標(biāo)記工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標(biāo)記部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
(4)酶的底物及供氫體的選擇:對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。
Elisa試劑盒——Elisa實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線
1 錯(cuò)誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品 加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品,重懸充分
2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤 按照說(shuō)明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
3 標(biāo)準(zhǔn)品污染 使用一次性的滅菌吸頭, 標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃
4 錯(cuò)誤的倍比稀釋步驟 按照說(shuō)明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
5 波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤 TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用,而 前者比色波長(zhǎng)為450nm,后者為492nm。雙波長(zhǎng)比色分析優(yōu)于單波長(zhǎng)。
6 標(biāo)準(zhǔn)品混用 不同批號(hào)試劑勿混用
7 試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng),溫度太高,標(biāo)準(zhǔn)品失活 盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間,夏季應(yīng)放冰塊降溫
8 ELISA未終止而直接檢測(cè)450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測(cè),否則會(huì)出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。(數(shù)值仍有梯度規(guī)律)
ELISA試劑盒主要實(shí)驗(yàn)原理
·包被:抗原或者能以物理性吸附于固相載體表面,原因是蛋白質(zhì)和聚乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,吸附之后能保持抗原反應(yīng)等活性;
·標(biāo)記:抗原或者可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其活性和酶的催化特點(diǎn);
·顯色:酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者結(jié)合后,也被固定在固相載體上,加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者的相對(duì)含量。