細胞實驗介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。共培養(yǎng)-定時間后進行破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一步采用RT-PCR對破骨細胞標志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據(jù)細胞熒光量計算病毒滴度。

細胞：在病毒前一天對細胞進行計數(shù)，接種約10000個細胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細胞的MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個梯度對細胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。雖然3D多細胞腫liu球模型具有更顯著的實體腫liu生理相關性，但是與2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對統(tǒng)一的3D多細胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過程和表征手段。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩(wěn)定表達情況。

實驗流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測；B 目的細胞病毒效果圖

MTT檢測

MTT 是一種檢測細胞存活和生長的方法。3%的上層瓊脂，每孔加1ml上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)，混勻，室溫凝固。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。

選擇實驗外包公司需要注意哪些事項？

報價

報價單一定要有明細。細胞實驗部分設備圖片公司目前擁有多項專利產(chǎn)品及技術(shù)，其中發(fā)明專利兩項，軟件著作權(quán)八項，實用新型專利三項，商標兩件。規(guī)范的外包公司會根據(jù)實驗方案里的各項內(nèi)容進行核算報價，材料是多少、人工檢測是多少，可以看到每一筆錢花在哪里，避免籠統(tǒng)的報價。另外注意不要一味地追求低價，做過實驗的都知道實驗成本，外包還需要考慮人工成本。如果價格過低，實驗數(shù)據(jù)就難以保證可靠和來源了。當然報價也不能虛高，做好是能在有限的經(jīng)費中盡量保證課題完整性?？梢砸蠊靖鶕?jù)預算來調(diào)整優(yōu)化方案，盡可能節(jié)約成本。