自噬(autophagy)是細(xì)胞受到刺激后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過(guò)程,自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu),內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和異常蛋白聚集物，損傷或多余細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、

病毒和細(xì)菌等。單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被于檢測(cè)自噬體形成的特異性標(biāo)記染色劑,其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm ,阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm。Leagene MDC染色液適用于培養(yǎng)細(xì)胞的自噬染色，可與EB合用雙染。去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm'的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過(guò)80。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

操作步驟

1.將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10m培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)zhen孔空隙時(shí)終止消化。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。一般室溫消化時(shí)間約為1- -3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。

附:消化液配制方法:

稱取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無(wú)Ca2 、Mg2 的Hank's液溶解，濾器過(guò)濾chu菌，4°C保存,用前可在379C下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達(dá)0.02%。

平板克l隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟::

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養(yǎng)液中備用。

2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200 個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37團(tuán)5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的數(shù)。后計(jì)算形成率。形成率= (數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) x100%平板形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。平板形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。以2x10*的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),加A配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(MFM。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞- -定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

支原體污染

支原體是隱蔽的污染物，不能通過(guò)過(guò)濾去除。顯微鏡下沒(méi)有任何可見的支原體污染跡象，比如細(xì)胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴(yán)重污染的培養(yǎng)基中），這樣就會(huì)導(dǎo)致我們產(chǎn)生錯(cuò)誤的安全感。而在牛中，支原體是常見的微生物之一。

解決方法：通常的過(guò)濾滅菌方法對(duì)支原體沒(méi)有影響。細(xì)胞一旦被支原體污染，特別是對(duì)重要的細(xì)胞系，必須去除支原體，一般的方法有、抗和抗與補(bǔ)體聯(lián)合。值得注意的是，支原體很突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁。因此，它對(duì)作用于細(xì)胞壁的生物合成（如 β-內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古等）完全不敏感，并且通常對(duì)多粘菌素、利福平和類具有耐藥性。3x106細(xì)胞懸浮于15mlMEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200ml培養(yǎng)瓶中。相反，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類對(duì)支原體的抑制作用很強(qiáng)，而氨基糖苷類和氯的抑制作用較弱。