PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因。”但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上分子克1隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以Khorana的設(shè)想被人們遺忘了。

1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長(zhǎng)度的第yi個(gè)PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專1利，

1987年7月28日批準(zhǔn)（專1利號(hào)4,683,202 ），Mullis是第yi個(gè)發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學(xué)術(shù)論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR術(shù)

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA.后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的DNA作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA的部分片段，大小取決于.上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段。

該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。

巢式PCR(NEST PCR枝術(shù).

先用一對(duì)靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量.然后再用一對(duì)內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的PCR帶。此為巢式PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCR。為減少 巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)些，且用量較少。同時(shí)在第yi次PCR時(shí)采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度。這樣在第yi次PCR時(shí)，由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合,故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過若干次循環(huán)。待外引物基本消耗盡，無需取出第yi次PCR產(chǎn)物，只需降低退火即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟。同時(shí)也降低了交叉污染的機(jī)會(huì)。這種PCR稱中途進(jìn)退式PCR( drop-in, drop-out PCR)上述三種方法主要用于少量DNA模板的擴(kuò)增。