分光光度法的概念

發(fā)送到樣品的光束由光子束構(gòu)成。

當光子遇到樣品中的分子時，分子可以吸收其中的一些分子，減少光束中的光子數(shù)量并降低檢測信號的強度。

透射率是穿過樣品的光的一部分。它被定義為在入射光強度下穿過樣品的光強度。

吸光度與透射率相反，對應(yīng)于分光光度計測量的量。

根據(jù)吸光度，溶液樣品中的濃度可以從比爾 - 朗伯定律確定，其表明吸光度和樣品濃度之間存在線性關(guān)系。根據(jù)Beer-Lambert定律，吸光度是吸收系數(shù)的乘積，吸收系數(shù)是給定波長下溶質(zhì)吸收的光量的量度，是光通過的距離。樣品，或行進距離，以及溶質(zhì)的濃度。通常，測量吸光度的目標是測量樣品的濃度。

常見分光光度計分類

(1)可見分光光度計

用來測量待測物質(zhì)對可見光(400～760nm)的吸光度并進行定量分析的儀器，稱為可見分光光度計?？稍?00nm測定細菌細胞密度。

(2)紫外可見分光光度計

紫外可見光譜儀用來測量待測物質(zhì)對可見光或紫外光(200～760nm)的吸光度并進行定量分析的儀器?？梢詼y定核酸和蛋白的濃度，也可以測定細菌細胞密度，紫外分光光度計又可分為單光束,假雙光束,雙光束。它們的用途又有區(qū)別。

使用分光光度計的步驟與方法

1）預(yù)熱儀器：為使測定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器時和在不測定時應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。

（2）選定波長：根據(jù)實驗要求，轉(zhuǎn)動波長調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長。

（3）固定靈敏度檔：根據(jù)有色溶液對光的吸收情況，為使吸光度讀數(shù)為0.2～0.7，選擇合適的靈敏度。為此，旋動靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。

（4）調(diào)節(jié)“0”點：輕輕旋動調(diào)“0”電位器，使讀數(shù)表頭指針恰好位于透光度為“0”處（此時，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照）。

（5）調(diào)節(jié)T=100%：將盛蒸餾水(或空白溶液或純?nèi)軇?的比色皿放入比色皿座架中的格內(nèi)，有色溶液放在其它格內(nèi)，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，轉(zhuǎn)動光量調(diào)節(jié)器，使透光度T=100%，即，表頭指針恰好指在T=100%處。

（6）測定：輕輕拉動比色皿座架拉桿，使有色溶液進入光路，此時表頭指針所示為該有色溶液的吸光度A，讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。

（7）關(guān)機：實驗完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。