1.抗活性Arf 6，小鼠單克l隆抗l體（貨號26918）：一小瓶– 22 μL（1

含50％甘油和0.05％疊氮l化鈉的PBS（pH 7.4）中的濃度（mg / ml）。 該抗l體特異性識別所有脊椎動物的Arf 6-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測定/裂解緩沖液（目錄號30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l體（貨號21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（目錄號30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS標(biāo)記0.5 mL細(xì)胞裂解液。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號30304）：一個樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP標(biāo)記0.5 mL細(xì)胞裂解物。

陽性對照和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個試管中（陽性對照）。

4，在第二個試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。

分析原理

基于構(gòu)型特異性抗Gα13-GTP的NewEast生物科學(xué)Gα13活化檢測試劑盒從細(xì)胞提取物或體外檢測活性Gα13-GTP水平的單克l隆抗l體GTPγS負(fù)載Gα13活化試驗。簡單地說，抗活性Gα13小鼠單克l隆抗l體用含有Gα13-GTP的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。結(jié)合的活性Gα13將被蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖。用兔抗α13多克l隆抗l體免l疫印跡法檢測沉淀的活性Gα13。