細(xì)胞實驗介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細(xì)胞，細(xì)胞實驗室，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計算病毒滴度。

細(xì)胞：在病毒前一天對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，接種約10000個細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細(xì)胞進(jìn)行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5個梯度對細(xì)胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，資陽細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，細(xì)胞實驗外包，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時加入puromycin對細(xì)胞篩選，篩選約2周時間。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實驗流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測；B 目的細(xì)胞病毒效果圖

自噬流檢測

自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點。由于自噬流是一個曲多個步驟組成的動態(tài)過程。因此往需要精細(xì)的突驗才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。

Q:中的沉淀物對細(xì)胞培養(yǎng)有什么影響？

A:（1）細(xì)胞生長，我們的試驗以及經(jīng)驗表明沉淀物不會影響細(xì)胞培養(yǎng)，我們的客戶以及其它生產(chǎn)商也證明了這一點。

（2）過濾，如果中出現(xiàn)大量的沉淀物，將很難過濾。一般說來，因為在生產(chǎn)工序中已經(jīng)過 100nm 或者 40nm 的過濾處理，細(xì)胞實驗，并且經(jīng)過了嚴(yán)格的無菌檢測，因此不推薦再過濾用于細(xì)胞培養(yǎng) 的。在實驗室中沒有必要再過濾處理，在大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)中往往將直接加到培養(yǎng)基中一起 過濾。

（3）污染，磷酸鈣往往被誤認(rèn)為微生物污染而引起。研究者可能會在中觀察到一些絮狀的 沉淀，因此就會比較警覺的去做無菌試驗，將放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結(jié)果可能會觀察到更多的絮狀 沉淀，因此就斷定被污染了。并且當(dāng)研究者將樣品放在倒置顯微鏡下觀察時往往可以看到一些可 以運動的小黑點，因此就更加確認(rèn)是被污染了。于是，研究者就會花費更多的時間和精力來和生產(chǎn)商 確認(rèn)，但終確定沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發(fā)生，我們建議不要直接將放在 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將加到瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)以觀察是否有細(xì)菌生長。另外，也可以進(jìn) 行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，以確認(rèn)是否有污染。

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