20.Primer設(shè)計(jì)的基本原則是什么？

答：引物設(shè)計(jì)的下列原則供您參考。

◆引物長度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3"端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

◆如果可能避免在3"端5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C。

◆如果可能避免在3"端1個(gè)堿基為A。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。

◆退火溫度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，PCR，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應(yīng)該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？引物化學(xué)合成，哪里有機(jī)會污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個(gè)20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組即某個(gè)物種或特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的RNA的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長時(shí)期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不相同的。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行cDNA測序，快速地獲取某一物種特定qi官或組織在某一狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本。相對于傳統(tǒng)芯片而言，RNA-Seq無需預(yù)先設(shè)計(jì)探針，即可對物種的細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測，能夠提供較的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的良好工具。

◆　HPLC

如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于，定向誘變或定量的基因探測，那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達(dá)不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個(gè)目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，pcr，對于達(dá)到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因?yàn)镠PLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度，用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

對于長的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，dna檢測，它使用交連的聚酰胺凝膠(電泳)作為純化基質(zhì)。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。

PCR-pcr-英瀚斯生物科技(查看)由南京英瀚斯生物科技有限公司提供?！敖M織病理,細(xì)胞生物,分子生物學(xué)平臺,動物模型科研外包服務(wù)”選擇南京英瀚斯生物科技有限公司，公司位于：江蘇省南京市棲霞區(qū)和燕路371號東南大學(xué)國家大學(xué)科技園科創(chuàng)樓A301，多年來，英瀚斯堅(jiān)持為客戶提供好的服務(wù)，聯(lián)系人：戴經(jīng)理。歡迎廣大新老客戶來電，來函，親臨指導(dǎo)，洽談業(yè)務(wù)。英瀚斯期待成為您的長期合作伙伴！