關(guān)于細胞培養(yǎng)的常見問題

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青&鏈）？

A：雙抗不是細胞生長必需的。我們培養(yǎng)細胞時不常規(guī)使用，因為連續(xù)使用會促進耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實驗室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細胞培養(yǎng)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？

A：我們強烈建議好使用細胞提供機構(gòu)或細胞庫推薦的生長培養(yǎng)液。有些細胞可能會適應在不同培養(yǎng)基中生長，細胞實驗外包費用，在做好保種的條件下，可以分出部分細胞做測試。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養(yǎng)皿) 培養(yǎng) 24 小時，使其達到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質(zhì)體復合物方法如下：

①在 1 mL 無 DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質(zhì)粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉(zhuǎn) 1 秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3) 棄去細胞中的舊液，用 1 mL 無 DMEM 洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質(zhì)體復合物，37℃ 培養(yǎng) 3～5 小時。

(4) 再于每孔中加入 20?S 的 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 14～24 小時，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮 10?S 的 DMEM，2 mL/孔，再培養(yǎng) 24～48 小時。

(6) 用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1) 接種細胞同前，細胞實驗外包哪家好，細胞長至 50% 板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20?S 的 DMEM，37℃ 培養(yǎng) 48 小時。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養(yǎng)液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染，方法參照細胞篩選法進行。

小鼠精原gan細胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個細胞，其中約有 2×104個是精原gan細胞，臺州細胞實驗，僅占gao丸生精上皮細胞總數(shù)的 0.02～0.03%，精原gan細胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細胞，再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來，細胞實驗外包公司，并在體外進行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%，CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%，CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%，二者都陽性細胞占 8.20±3.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1)，CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子，percoll離心后細胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細胞純度

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