2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆　脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-乙氧基--磷酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)，以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基（苯甲?；彤惗』┍蝗コ?，從而形成了天然的DNA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎(chǔ)生物研究。

◆　BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，則N-寡核苷酸包含5’-DMT基團(tuán)，提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因?yàn)镈MT基有強(qiáng)的親脂的特性，有5’-DMT基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)，所以，我們能夠成功的把想要的N-寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。

動物組織細(xì)胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，甘孜pcr，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，基因檢測怎么做，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ，10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

16.長鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？

答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。

17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測1-2個(gè)就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個(gè)突變的位點(diǎn)都不一樣，fish檢測，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測幾個(gè)，否則就重合一下引物。

基因檢測怎么做-英瀚斯生物科技-甘孜pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司堅(jiān)持“以人為本”的企業(yè)理念，擁有一支高素質(zhì)的員工隊(duì)伍，力求提供更好的產(chǎn)品和服務(wù)回饋社會，并歡迎廣大新老客戶光臨惠顧，真誠合作、共創(chuàng)美好未來。英瀚斯——您可信賴的朋友，公司地址：江蘇省南京市棲霞區(qū)和燕路371號東南大學(xué)國家大學(xué)科技園科創(chuàng)樓A301，聯(lián)系人：戴經(jīng)理。