細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分設(shè)備圖片

公司目前擁有多項產(chǎn)品及技術(shù)，其中發(fā)明兩項，軟件著作權(quán)八項，實(shí)用新型三項，商標(biāo)兩件。公司先后獲得“江蘇省民營科技企業(yè)”、“江蘇省科技型中小企業(yè)”、“江蘇省專精特新中小企業(yè)”等榮譽(yù)資質(zhì)，連續(xù)多年被評為“東南大學(xué)國家大學(xué)科技園企業(yè)”。2019年公司成為江蘇省生物技術(shù)協(xié)會第七屆理事會的特邀理事，成立了“李冬冬創(chuàng)新工作室”，并獲得了南京市“工人先鋒號”的榮譽(yù)稱號。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞，進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時，流式細(xì)胞檢測，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，轉(zhuǎn)染，檢測PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，癌細(xì)胞，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來識別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測圖；B 細(xì)胞凋亡檢測圖

軟gu細(xì)胞培養(yǎng)

(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺，剔除關(guān)節(jié)周圍附著的軟組織，打開髖、膝關(guān)節(jié)，用尖刀削取關(guān)節(jié)軟gu組織，置入裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿，防止軟gu組織被風(fēng)干。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，將細(xì)小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min，細(xì)胞，收集細(xì)胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細(xì)胞混懸液。

(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細(xì)胞生長情況并拍照保存。

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