細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

霉菌污染

正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，細(xì)胞實驗外包哪家好，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見絲狀和團塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，江西細(xì)胞實驗，雖然細(xì)胞仍在生長，但它們的生命狀態(tài)會在長時間后逐漸惡化。

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉(zhuǎn)移所有細(xì)胞，并立即使用 guo 氧擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧放在培養(yǎng)箱中一小時，使蒸汽擴散，待 guo 氧氣味消散后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，細(xì)胞實驗外包選哪家，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

線菌素 D 或青鏈。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述，也沒有什么區(qū)別。對于支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)，選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，細(xì)胞實驗外包公司，消毒環(huán)境。如果所有的細(xì)胞都被污染了，那可能是整個培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對培養(yǎng)基和實驗設(shè)備進行檢查。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實驗操作步驟的規(guī)范。

選擇實驗外包公司需要注意哪些事項？

1. 實地考察

可以到公司實地考察一下實驗室，看一下實驗室環(huán)境、設(shè)備儀器情況，是否能滿足實驗方案所需條件。能整體承接課題，動物細(xì)胞。一些大型儀器公司不一定有，看有沒有高校平臺資源渠道共享。確保是真實進行實驗的，這樣后續(xù)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)也比較可靠。

2. 方案評估

實驗合作前期一般會進行所需實驗內(nèi)容的評估，來確定終實際實驗方案和報價。方案評估可以看出外包團隊的性。一個可靠的外包公司會對方案提出針對性的建議，評估各項實驗是否能做，以及根據(jù)預(yù)算情況和實際操作對細(xì)節(jié)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。任何實驗都是有不確定性的，但是前期敲定好方案能為后續(xù)實際開展實驗打下良好基礎(chǔ)，也會省去許多隱患和麻煩。

細(xì)胞實驗介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計算病毒滴度。

細(xì)胞：在病毒前一天對細(xì)胞進行計數(shù)，接種約10000個細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細(xì)胞進行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5個梯度對細(xì)胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強度。同時加入puromycin對細(xì)胞篩選，篩選約2周時間。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實驗流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測；B 目的細(xì)胞病毒效果圖

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