4.  各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，－2~－3℃/ 分鐘合適；胚胎細(xì)胞耐受性較小，不宜太快。總之在一開始時(shí)，下降速度不能超過(guò)－10℃/ 分鐘。

5.  用什么防護(hù)劑合適和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用 DMSO 較好，流式細(xì)胞檢測(cè)，一般細(xì)胞可用甘油；用量以較小為好。有人認(rèn)為膚上皮細(xì)胞貯存在 20%-30% 甘油中很好。

6.  原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見(jiàn)，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。

7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，流式細(xì)胞，要做好防護(hù)工作，以免

8. 注意自身的安全，對(duì)于來(lái)自人源性或病毒的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如 DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細(xì)胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養(yǎng)皿) 培養(yǎng) 24 小時(shí)，使其達(dá)到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在 1 mL 無(wú) DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質(zhì)粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉(zhuǎn) 1 秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3) 棄去細(xì)胞中的舊液，用 1 mL 無(wú) DMEM 洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃ 培養(yǎng) 3～5 小時(shí)。

(4) 再于每孔中加入 20?S 的 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 14～24 小時(shí)，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮 10?S 的 DMEM，2 mL/孔，再培養(yǎng) 24～48 小時(shí)。

(6) 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1) 接種細(xì)胞同前，轉(zhuǎn)染，細(xì)胞長(zhǎng)至 50% 板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20?S 的 DMEM，細(xì)胞，37℃ 培養(yǎng) 48 小時(shí)。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

目的

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。

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