二、大腸菌群檢驗方法:

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。 目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有和原國家商檢局制訂的行業(yè)標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。

(一):采用三步法，即:乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。乳糖發(fā)酵試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36士1C培養(yǎng)48土2h，觀察是否產氣。分離培養(yǎng):將產氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36士1°C培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。證實試驗:挑取平板上的菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36士1°C培養(yǎng)24土2h，基因檢測怎么做，觀察產氣情況。

報告:

根據證實為大腸陽性的管數，查MPN表，報告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789. 3-94 《中華人民共和國食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群測定》

(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸進行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養(yǎng)48士2h，觀察是否產氣。證實試驗:將產氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養(yǎng)48士2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查MPN表，涼山pcr，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，dna檢測，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，PCR，就多測幾個，否則就重合一下引物。

◆　HPLC

如果合成的寡核苷酸應用于，定向誘變或定量的基因探測，那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對于達到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因為HPLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度，用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

對于長的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚酰胺凝膠(電泳)作為純化基質。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導致純化產率的下降。

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