蛋白質(zhì)雙向電泳實驗流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.雙向電泳分離待測樣品

(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進(jìn)行。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/mL，否則會造成蛋白質(zhì)的聚集或沉淀。

(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），青海pcr，若不立即進(jìn)行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。

(3)等電聚焦好的膠條按廠商提供的操作手冊平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。儀器設(shè)置為2.5W/膠 45min，15W/膠 5-8hr，20℃。

3.銀染法對凝膠進(jìn)行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗

3.凝膠掃描及圖像分析

(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進(jìn)行掃描。

(2)圖像分析：掃描完畢后，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。掃描后的圖像用ImageMaster 2D Platinum software軟件進(jìn)行分析。分析按照軟件廠商提供的說明書進(jìn)行。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點。以目標(biāo)蛋白質(zhì)3個重復(fù)具有相同趨勢，目標(biāo)蛋白質(zhì)相鄰位點的相對一致性，至少2個重復(fù)有2倍以上差異作為判定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

RNA提取

1.棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次1-2。

2.棄去PBS，用1000u1吸干凈殘余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管標(biāo)號與每孔相對應(yīng)備用。

5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的 EP管中國。

6.往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s， 冰上靜置12min[問l。

7. 所有樣品4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 15min.

8. 再次標(biāo)記一批同樣編號EP管。

9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號的EP管中，再加入400ul異充

分混勻。4C冰箱35min。

10. 4C離心，pcr引物設(shè)計，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 10min.

11.棄去.上清液，加1m175%乙醇，輕搖7]。

12. 4C離心，10600轉(zhuǎn)/分鐘，時間: 5min.

13. 棄上清液濾紙吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測濃度。

組織RNA提取

1、剪米粒大小組織塊放入EP管中標(biāo)號。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜。

4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆　脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-乙氧基--磷酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)，以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基（苯甲?；彤惗』┍蝗コ瑥亩纬闪颂烊坏腄NA結(jié)構(gòu)。然而，PCR實驗室，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機(jī)雜質(zhì)，熒光定量pcr，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎(chǔ)生物研究。

◆　BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，則N-寡核苷酸包含5’-DMT基團(tuán)，提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因為DMT基有強(qiáng)的親脂的特性，有5’-DMT基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)，所以，我們能夠成功的把想要的N-寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。

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