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基因(遺傳因子)是產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所需的全部核苷酸序列?;蛑С种幕緲?gòu)造和性能。儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的全部信息。環(huán)境和遺傳的互相依賴,演繹著生命的繁衍、細胞分裂和蛋白質(zhì)合成等重要生理過程。生物體的生、長、衰、病、老、死等一切生命現(xiàn)象都與基因有關(guān)。它也是決定生命健康的內(nèi)在因素。因此,基因具有雙重屬性:物質(zhì)性(存在方式)和信息性(根本屬性)。帶有遺傳信息的DNA段稱為基因,其他的DNA序列,有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用,有些則參與調(diào)控遺傳信息的表現(xiàn)。組成簡單生命少要265到350個基因。(這涉及基因工作組的力量,人類的基因工作組與果蠅的基本相似)
腺病毒表達
腺病毒系統(tǒng)是很受歡迎的可以在任何哺乳動物細胞中有效瞬時表達的基因遞送平臺。對于難轉(zhuǎn)染的細胞,如原代或非分裂細胞,采用病毒遞送外源基因的方式是非常有效的選擇。鐘鼎生物采用293A腺病毒包裝細胞系(含有腺病毒包裝所必需的E1基因序列,逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定,是專為生產(chǎn)腺病毒和進行滴度測定而建立的),用于高滴度的copy缺陷型(E1和E3缺失)腺病毒的生產(chǎn),以進行外源基因的表達。腺病毒感1染幾乎所有的細胞類型,除了一些抗腺病毒感1染的淋巴1瘤細胞。腺病毒是研究原代非增殖細胞基因表達的zui佳系統(tǒng),它可以使轉(zhuǎn)化細胞和原代細胞中得到的結(jié)果直接進行對比;不整合到染色體中,無插入致突變性。能有效進行增殖,滴度高:腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生108 pfu/ml原液,濃縮后可達1010-1011 VP/ml,這一特點使它非常適用于基因cure。
典型的腺病毒載體系統(tǒng)如:穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細胞293細胞。pCA13/的HCMV IE啟動子-多克1隆位點-SV40 AN(poly A)構(gòu)成外源基因的表達盒,該表達盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其兩端側(cè)翼序列(左側(cè)的1~3bp的ITR,右側(cè)從3.5kb到末端的維持病毒裝配和活力必須的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包裝信號
φ(194~358bp);pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分,但是缺失了包裝信號φ、0.5~3.7圖距(mu)部分的E1區(qū)、77.5~86.2mu的E3區(qū),293細胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen細胞系。pBHG11因為缺失包裝信號及E1區(qū)而不能copy,pCA13帶有包裝信號及E1的側(cè)翼序列,但是缺失E1區(qū)及腺病毒絕大部分基因組,同樣不能copy。外源目的基因插入pCA13后,與pBHG11共轉(zhuǎn)染,進入293細胞。pCA13與pBHG11在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組,同時,293細胞提供E1蛋白,從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野1生型腺病毒相似,具有同樣的感1染力進入靶1細胞的能力,但是基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代,即進入靶1細胞后病毒不能copy,但可以表達目的蛋白。
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