反向PCR( Inverse PCR， IPCR術(shù)

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無切點的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA.后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產(chǎn)物是線性的DNA的部分片段，大小取決于.上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段。

該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

PCR反應特點

靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶1細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中zui小檢出率為3個細菌。

簡便、快速：PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，含基因組DNA去除試劑盒，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放1射性污染、易推廣。

純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

PCR法不僅僅局限于分子生物學，還因其簡便、迅速等特點被廣泛應用于醫(yī)學、法醫(yī)學、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗、動植物檢驗等其它領域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應有時會出現(xiàn)錯配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克1隆、變異導入等實驗中，需加以注意。

2. 擴增的DNA長度：使用Taq DNA Polymerase進行PCR擴增時，通?？蓴U增幾kb的DNA，超過10 kb則比較困難。這就給利用PCR進行Mapping等Genome解析帶來麻煩。

3. 擴增量：使用Taq DNA Polymerase進行PCR產(chǎn)物克1隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗等時，擴增量常常達不到要求。為解決以上難題，Takara在對Polymerase、Buffer及反應條件等進行深入研究的基礎上，開發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術(shù)，運用此技術(shù)可大量正確地擴增長達40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技術(shù)擴展了PCR的應用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長片段 DNA的克1隆及變異導入等方面發(fā)揮優(yōu)勢。

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