PCR技術(shù)的基本原理

PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和四種dNTP等存在的條件下.依賴于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步:變性、退火、聚合。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一 循環(huán)的產(chǎn)物DNA又可以作為下一個(gè)循環(huán)模板，數(shù)小時(shí)后，介于兩個(gè)引物之間的目的DNA得到了大量的copy，經(jīng)25~ 30次循環(huán)DNA數(shù)量可達(dá)2x1067拷貝數(shù)。

錨定PCR(Anchored PCR. APCR技術(shù).

用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3"-末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，稱為APCR.應(yīng)用:它可用于擴(kuò)增未知或全知序列，如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

原位PCR( in situ PCR)技術(shù)

原位PCR綜合了PCR和原位雜交( Insitu hybridization， ISH)的優(yōu)點(diǎn)是一種在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對(duì)特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增.再用特異性的探針原位雜交檢測(cè)。原位PCR標(biāo)本一般需先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜有一定的通透性，PCR擴(kuò)增所需的各種成分可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)。在原位對(duì)特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過(guò)細(xì)胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應(yīng)用ISH將其檢出，同時(shí)還可對(duì)目的DNA序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常12鐘溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。

工作模式和原理同普通PCR儀一樣，它出了又普通PCR儀的功能外還多了一個(gè)梯度退火功能。DNA部分片段的擴(kuò)增對(duì)溫度的控制精度要求特別高，不同的DNA部分片段其退火溫度不一樣，通過(guò)計(jì)算DNA部分片段中的CG堿基的含量只能初步的判斷出zui優(yōu)退火溫度在 5℃范圍內(nèi)，如果用普通PCR儀進(jìn)行研究，需重復(fù)擴(kuò)增很多次，然后做電泳進(jìn)行分析來(lái)確定zui優(yōu)退火溫度。而梯度PCR儀則只需要一次就可以完成，在節(jié)省了時(shí)間的同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下，梯度PCR儀也可以做普通PCR擴(kuò)增。

該儀器主要應(yīng)用于科研，一步法RT-PCR試劑盒，教學(xué)機(jī)構(gòu)，醫(yī)學(xué)臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。

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