熒光染料***用于生物學和醫(yī)學研究中，如流式細胞術、熒光顯微鏡和免疫組化等，其中熒光淬滅是一個關鍵的考量因素，因為它直接影響到實驗結果的可靠性和準確性。FITC（異硫氰酸熒光素）是一種常用的綠色熒光染料，具有較高的熒光量子產率和激發(fā)效率。然而，F(xiàn)ITC的一個主要缺點是容易受到環(huán)境因素的影響，如pH值、溫度、溶劑和離子強度等，從而導致熒光淬滅。此外，F(xiàn)ITC的光穩(wěn)定性相對較低，長時間的光照會導致其熒光強度降低。CY5.5是一種遠紅外熒光染料，具有較長的激發(fā)和發(fā)射波長，因此適用于多色熒光標記和深組織成像。CY5.5相對于FITC來說，具有更好的光穩(wěn)定性，不易受到環(huán)境因素的影響。此外，CY5.5的熒光量子產率也較高，使其在熒光標記實驗中表現(xiàn)出色。AlexaFluor647是另一種常用的紅色熒光染料，具有與CY5.5相似的長波長激發(fā)和發(fā)射特性。AlexaFluor647的優(yōu)點是光穩(wěn)定性較好，可以承受長時間的光照而不易淬滅。此外，它在多種溶劑和pH值范圍內都能保持穩(wěn)定的熒光性能，因此在復雜的生物樣本中表現(xiàn)出色。

南京星葉生物科技有限公司Super Fluor系列（效果同Alexa Fluor 系列），質優(yōu)價廉。 目前常用標記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。上海重慶熒光染料

SuperFluor活化酯（與Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同）SuperFlour系列熒光探針，具有更強的熒光強度，更廣的pH應用范圍（pH4～10）,更好的抗淬滅性。在生物熒光領域已逐漸替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等熒光染料。1．標記效率低——計算結果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團少于4mol有以下原因：1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應降低了標記效率。如果蛋白已經溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標記前用PBS透析。2）蛋白含量較低(≤1mg/mL)會影響標記效率。3）標記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環(huán)境中標記反應的效率比較高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調節(jié)至**適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1M碳酸氫鈉透析等。4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標記效率和標記速度（只需10min）明顯改善。5）不同抗體與熒光團的反應速率不同，染料標記后保留的生物活性程度也不同，因此標準步驟也不是總有比較好的標記結果。為增加標記率，可以對同一樣品進行再標記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜，情況有所改善。湖北免疫組化熒光染料D-熒光素是熒光素酶 (Luc) 的天然底物，可催化螢火蟲產生典型的黃綠色光。

一：染色液制備1、配制儲液：儲液用無水DMSO或無水EtOH配制，濃度1~5mM。注：未使用的儲液建議分裝后儲存在-20℃，避免反復凍融。2、工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲液，配制濃度為1~5μM的工作液。注：工作液**終濃度建議根據(jù)不同細胞系和實驗體系來優(yōu)化。建議從推薦濃度的10倍范圍內開始比較好濃度的摸索。二：懸浮細胞染色1、加入適當體積的染色工作液重懸細胞，使其密度為1×106/mL。2、37℃孵育細胞2~20min，不同的細胞比較好培養(yǎng)時間不同?？梢?0min作為起始孵育時間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標記效果。3、孵育結束，1000~1500rpm離心5min。傾倒上清液，再次緩慢加入37℃預熱的生長培養(yǎng)液重懸細胞。4、重復步驟3兩次以上。

Cy5:激發(fā)波長633/635nm，比較大發(fā)射波長670nm。1)其標記的抗體適用于所有配備633nm氟離子激光器的流式細胞儀;2)在流式細胞儀的FL4通道檢測;3)適用于熒光顯微鏡技術;4)同樣為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細胞術，熒光強度低于APC。5)與單核和粒細胞非特異性結合多，易出現(xiàn)假陽性結果。

5、PE:激發(fā)波長488nm，比較大發(fā)射波長575nm。1)其標記的抗體適用于所有配備488nm氯離子激光器的流式細胞儀:2)在流式細胞儀的FL2通道檢測;3)其熒光泯滅性強，不適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術，但適用于激光共聚焦顯微鏡技術。

6、PE-TR:激發(fā)波長488nm，比較大發(fā)射波長615nm。1)在BeckmanCoulter流式細胞儀的FL3通道檢測;2)可適用于小功率激光器的流式細胞儀，也可使用于大功率激光器的大流式細胞儀。

7、PE-AlexaFluor610:激發(fā)波長488nm，比較大發(fā)射波長628nm。1)在BeckmanCoulter流式細胞儀的FL3通道檢測;2)熒光強度高;3)可適用于小功率激光器的流式細胞儀，也可使用于大功率激光器的大流式細胞儀。 染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標記細胞膜和疏水性組織。

一種發(fā)光雜環(huán)化合物，存在于生物發(fā)光的生物體中，如螢火蟲。在含有三磷酸腺苷的情況下，通過熒光素酶氧化脫羧產生光?？捎糜跓晒馑孛干锇l(fā)光成像和細胞高通量篩選應用。D-熒光素（D-Luciferin）是螢火熒光素酶底物，其量子效率為0.88，是Luminol的20倍。反應原理：首先，在鎂離子存在下熒光素酶使熒光素與ATP反應，接著它被氧化形成二氧雜環(huán)丁烷結構并發(fā)出黃綠色的光。Luciferin-luciferase發(fā)光用于ATP監(jiān)控以測定細胞活力以及細菌計數(shù)。它還用于報告基因檢測。可與小動物***成像系統(tǒng)配套使用，用于標記LUC基因后的體內***熒光檢測。D-熒光素游離酸（D-Luciferin,freeacid）、D-熒光素鉀鹽（D-Luciferin,potassiumsalt）和D-熒光素鈉鹽（D-Luciferin,sodiumsalt），鉀鹽、鈉鹽的形式是**通用的，因為它們都易溶于水。鉀鹽也是***動物檢測使用的主要形式。它們的激發(fā)和發(fā)射波長分別為328nm和533nm。Cy7 DiC18（DiR）是一個親脂性、近紅外熒光花青染料，這個染料常用于標記細胞質膜。河北高分子熒光染料

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使用螢火蟲熒光素酶（Fluc）作為報告基因和 D-熒光素作為底物的生物發(fā)光成像（BLI）是目前應用*****的技術。將總信號強度相對于 D-熒光素注射后的時間進行繪制，以生成時間-強度曲線。除了峰值信號外，還確定注射 D-熒光素后固定時間點（5、10、15 和 20 分鐘）的信號作為峰值信號的替代。給定時間-強度曲線中的信號針對曲線中的峰值信號進行歸一化，以表示 D-熒光素注射后時間變化的模式[3]。每克體重注射 10 μL D-熒光素（腹膜內或靜脈注射）儲備液：對于 20 g 小鼠，標準 150 mg/kg 注射通常約為 200 μL。在室溫下解凍 D-熒光素（鉀鹽或鈉鹽）并溶解在 dPBS（不含鈣或鎂）中，**終濃度為 15 mg/mL。通過吸取 5-10 mL 無菌水來預濕 0.22 μm 過濾器。上海重慶熒光染料