差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術(shù)

d-PCR可以定量檢測(cè)標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個(gè)單拷貝的參照基因置于一個(gè)試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5°-端標(biāo)記上放1射性核素后.通過(guò)檢測(cè)兩條區(qū)帶放1射性強(qiáng)度即可測(cè)出目的基因的拷貝數(shù)。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術(shù)

qPCR技術(shù)是用合成的RNA作為內(nèi)標(biāo)來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增.但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物.可容易地電泳分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達(dá)。能提供特定DNA基因表達(dá)水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價(jià)值。

PCR有哪些應(yīng)用領(lǐng)域？

基因表達(dá)

通?？赏ㄟ^(guò)PCR來(lái)檢測(cè)不同細(xì)胞類型、組織和生物體在特定時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)差異。首先，從目標(biāo)樣品中分離出RNA并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，通過(guò)由PCR擴(kuò)增的cDNA數(shù)量，確定mRNA的初始水平。這一過(guò)程也被稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。

終點(diǎn)PCR 可通過(guò)凝膠里的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶強(qiáng)度對(duì)RNA的表達(dá)進(jìn)行定量（一種半定量方法）。例如，對(duì)起始cDNA進(jìn)行連續(xù)稀釋并擴(kuò)增。通過(guò)凝膠電泳使不同起始量的終點(diǎn)PCR得率可視化，然后對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，并以管家基因?yàn)閰⒄者M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，預(yù)估擴(kuò)增靶點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)水平。如今，終點(diǎn)PCR已基本被實(shí)時(shí)PCR 或qPCR 取代了，因?yàn)樗鼈兛色@得和的基因表達(dá)定量結(jié)果。

 PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為DNA部分片段,細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)1制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2 )。

[PCR步驟]標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步:

1.DNA變性(90°C-96*C): 雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火(25C-65'C): 系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)copy完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60°C -65C間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提

高了反應(yīng)速度。

污染原因：

1、標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

2、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中主要常見(jiàn)的污染問(wèn)題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽(yáng)性。還有一種容易忽視，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。

4、實(shí)驗(yàn)室中質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)橘|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在內(nèi)的質(zhì)粒，由于的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。