核酸試劑盒

RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，反應(yīng)溫度在37°C左右。

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非?？?/span>，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。擴(kuò)增結(jié)果可以通過凝膠電泳進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個(gè)基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，就可以實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用。舉例來說，TwistAmp? exo結(jié)合了exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應(yīng)終點(diǎn)的擴(kuò)增子總量有所減少，適合獲得強(qiáng)熒光信號(hào)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，不適合終點(diǎn)檢測(cè)(比如跑膠)。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合起來，可以一步實(shí)現(xiàn)RNA模板的實(shí)時(shí)擴(kuò)增。

等溫核酸試劑盒

RPA技術(shù)犀利在何處

常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的溫度在37°C - 42°C之間，無需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。據(jù)介紹，RPA檢測(cè)的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)

模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)。

PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是對(duì)待檢測(cè)樣本中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的一種方法。熒光PCR法，又稱qPCR法（Quantitative Real-time PCR, qPCR），是生物分子熒光技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，即指在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的過程中，加入以熒光化學(xué)物質(zhì)，并以熒光強(qiáng)度來測(cè)定PCR循環(huán)后產(chǎn)物中核酸水平。

熒光PCR的概念于1992年被日本科學(xué)家提及，并在4年后由美國公司ABI實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。如今，ABI公司在熒光定量PCR儀制造界的地位仍不可撼動(dòng)，其三代產(chǎn)品ABI 7500 Real-time PCR system是使用很廣泛的熒光定量PCR儀。